肌肉切片於現有文獻最早可追溯至 Dr. Guillaume Duchenne de Boulogne (1806-1875)（沒錯，他就是發現Duchenne muscular dystrophy的那個法國神經學專家Duchenne），他使用了他稱之為 l'emporte-pièce histologique（又被稱為Duchenne's trocar）去執行肌肉切片並做觀察。¹ 而且除了肌肉切片外，他在神經傳導檢查（Nerve conduction study）的發展上亦有所貢獻。而現代神經學之父Jean-Martin Charcot 亦曾受教於Duchenne de Boulogne。²

過去

肌肉切片本身不難上手，染色在現有的專業分工下（也因為健保給付），大概都是由病理部專人執行。但反而是在染色前處理（preprocessing）有不少細節需要注意，若沒有注意，則會造成在染色後切片卻無法判讀的困境。筆者在學習的過程中，在台大楊智超教授及台北榮總林恭平教授的指導下，跌跌撞撞也花了大約一年的時間才做出可行的前處理，以供後面病理部同仁執行切片染色，因此謹將這份心得整理如下提供給學會會員參考。

在學習肌肉切片時，第一個遇到的問題大概都是「為什麼一定要做冷凍固定、而不是一般外科病理（Surgical pathology）最常使用的 formalin、formaldehyde、paraformaldehyde 的化學固定方法呢？」。而這主要是因為我們肌肉切片中經常使用到的histochemical staining。 現有常使用的染色方法，可以根據染色的原理將其概分成四種：

1. Histological staining：

這個類型包含了最常用的Hematoxylin and eosin (H&E)、Gormori-Trichrome staining、Oil-O red、 Period Acid-Schiff staining (PAS)、period AcidSchi staining with Diastase (dPAS)…… 等等。 這類型是運用染劑的各項物理化學性質，在肌肉組織的各種細部結構的不同親和性，進而產生不等程度的染色以產生對比，從而鑑別出各種細節結構如細胞核、粒腺體、膠原蛋白纖維（Collagen ber）。而這類型的染色方法，可以用於冷凍固定和化學固定的肌肉組織，但仍有一些個別染色方式只能用冷凍固定，需特別注意，如脂肪會在formalin 固定過程中，會接觸到酒精（ethanol；脫水）及二甲笨（Xylene；緩衝液以協助石蠟浸潤）進而使油滴流失，故欲觀察油滴、脂肪則仍需使用冷凍固定。

2. Histochemical staining：

這個類型包含了ATPase staining in pH 4.3, 9.4 or 10.42、NADH、SDH。這類型的染色方法是藉由肌肉組織中的所含的各式蛋白質的獨特化學性質，加上相對的作用物，產生獨特的化合物，進一步呈色，如 ATPase 則是在特定的 pH 值 下，讓其中一個 type 的 muscle ber ATPase 持續作用，使 ATP 分解成 ADP 及 Phosphate，接著使用 Calcium 去和 Phosphate 形成 Calcium phosphate 沉澱物， 進而再用 Cobalt 去置換 Calcium形成 Cobalt phosphate，最後再用 sulphide 去置換 phosphate 產生 Cobalt sulphide（黑色），進而呈色。故此類染色之蛋白質不能變性，所以若使用化學固定法則蛋白質會變性，導致染色無法執行，因此這類染色都需使用 snap freezing xation 的方式。

3 . Immunohistochemical (IHC) or immunouorescence (IFE) staining：

此類為免疫染色，是用專一性極強的第一抗體去辨認我們想要觀察的物質的抗原表位（epitope），接著再用第二抗體去辨認我們的第一抗體（也是種蛋白質），而第二抗體則可以使用化學呈色（ABC）或螢光呈色來使我們可以觀察肌肉組織切片。

4. Electron microscopy：電子顯微鏡。

在做冷凍固定的時候，經常會產生 freezing artifact，這會使顯微結構扭曲而造成判讀困難。為避免這種情況的發生，可以使用蔗糖溶 液（Sucrose solution）4℃ overnight 去置換水份，以防止 freezing artifact 發生，但這樣一整晚的置換過程，可能會導致蛋白質變性，因此也不適合用此方式執行 Histochemical staining。 而為什麼會有 freezing artifact 呢？這主要是因為水在固體的型態中會有三種型式，其中兩種（hexagonal crystal、cubic crystal）會是以結晶的方式形成，這樣就會產生 freezing artifact；第三種型式為 vitreous/amorphous form，不會有結晶的產生，而這是我們希望達到的情形。如要產生 vitreous form 的水，則要急速冷凍（snap freezing）才能達到。^3,4

至於為什麼不能直接使用液態氮冷凍檢體，而要間接先用液態氮先將 isopentane 達到凝固點再用 isopentane 去冷凍檢體？則是因為 液態氮的汽化點（-196℃）太低，所以冷凍肌肉的過程中，會在肉外面形成一層氮氣，而氣體的熱傳導極慢，導致肉在冷凍的過程速度不夠快，因此才會挑選 isopentane（凝固點 / 熔 點 -159.77 ℃）來將肌肉檢體做冷凍固定，而且筆者在 Ikuya Nonaka 教授及 Ichizo Nishino 教授的演講中學習到，他們都強調要在冷凍固定的過程，在 isopentane 中快速搖動（shaking as fast as possible），才能達到最快速的降溫。

至於如何判讀肌肉切片是個大哉問，絕不可能在這篇文章中就講完。但在學習的過程中，建議可以先行閱讀相關文獻或教科書（筆者建 議的文獻列於參考資料5-7），接著不斷的實戰， 結合臨床其他資料（基因檢測、血清學、電生理檢查等等），並定時跟前輩師長及病理部同 仁討論及共同閱片是進步的不二法門。

現在

在次世代定序（Next generation sequencing）於臨床實務中廣泛使用後，肌肉切片的在臨床的角色有極大的改變！以往在診斷遺傳性肌肉疾病特別是孟德爾遺傳模式（Mendelian inheritance）時，臨床醫師最困擾的地方是表現型（Phenotype）和基因型（Genotype）不是個 一對一函數，常有單一基因有多種表現型（基因多效性；Gene pleiotropy），或好幾種基因都有同樣一個表現型，更別說是多基因遺傳模式之疾病了。因此如何找到那個診斷的關鍵表現（Key point），進而安排合適的基因檢測以找出致病基因，則是端看臨床醫師之診斷功力了。 以前學生時代看到師長們精準帥氣地猜中是哪一個基因，都是令人津津樂道的回憶啊！

而次世代定序的發明並應用於臨床服務後，改變了許多的臨床情境。以往我們需要做很多檢查，才能試著去猜測可能的致病基因，但現在我們可以在排除常見之次發性病因後，根據病史、家族史懷疑是遺傳性肌肉病變後， 就可以直接安排次世代定序基因檢查去排查可能的致病基因，而從文獻上，次世代定序大約可以找到 50-60% 的致病基因。^8-10 因此，曾有人認為肌肉切片已無角色，以後直接做基因檢測就好。但筆者認為這還言之過早，我們對於基因體學的瞭解雖然這幾年進步神速，進展很多，但在浩瀚的知識大海中，我們仍屬無知。就筆者經驗，能夠單靠次世代定序基因檢 測的結果，就可以放心做出診斷的仍屬少數；大部份的個案仍需要進行基因型導引之各面向檢查（Genotype-guided examination）來做臨床驗證，而其中肌肉切片常是最重要且無法忽略的一項檢查，畢竟觀察受到影響的器官組織仍是最直接的黃金診斷方法。而在切片的同時，我們也可以安排特定的分子學檢驗來做基因檢測的臨床驗證 （eg. muscle mt.DNA copy number and mitochondrial DNA sequencing in muscle in patients with mitochondrial depletion syndrome）。¹¹

當然有時候我們也會選擇先做肌肉切片排除次發性病因後，再來做自費的基因檢測，但考慮到切片是個侵入性處置，病患不太可能會答應做完基因檢測找到可能致病基因後，再做一次肌肉切片。因此筆者建議將肌肉切片視為一個取得肌肉檢體的方式，而取到的檢體則是可以用於病理組織學判讀、分子生物學檢驗或肌肉細胞基因檢測（somatic variant or mitochondrial DNA）。而我們在執行muscle biopsy 時，則是要以「一期一會」（いちごいちえ）的心態，在病人安全的前提下，經過病人同意，將肌肉檢體做完整的保存，以提供未來診斷使用。

未來

在對於臨床懷疑的遺傳性肌肉病變病人的基因診斷中，以現有的次世代定序合併肌肉切片診斷流程中，仍有 30-40%之病患尚未找到可 能的致病原因，而這可能的原因來自於罕見之次發性病因或次世代定序的先天限制。^8,10 如為罕見之次發性病因，筆者建議再重新評估病人，思考是否有忽略的地方，同時以刑警查案的方式，將書上列出所有可能的病因一一排除，並且可以在各醫院內或院際之間的研討會議中提出討論，尋求師長同事的意見。

而在次世代定序的先天限制上（eg. intronic variant, structural variant, or repeat expansion disease 等等），除了使用全基因體定序（Whole genome sequencing with/without long read sequencing）外，已經有不少國際團隊在使用多細胞肌肉轉錄體學（muscle transcriptome by bulk transcriptome ） 協助診斷疾病。 肌肉轉錄體學可以去評估基因的表現量（expression analysis）、等位基因表現不平衡（allelic imbalance）或變異點偵測（variant calling），但其中的表現量分析需要有控制組才能完成。¹²

而轉錄體學進一步的研究則可以考慮單細 胞轉錄體學（single cell RNAseq）及空間轉錄體 學（spatial transcriptome）。單細胞轉錄體學是 將解析度以單顆細胞的程度來做轉錄體學的分 析。¹³ 而空間轉錄體學則是在轉錄體學的分析 上面，加上空間的分析，可以去觀察 肌肉切片 下，各區域細胞的轉錄體學分析，但其解析度 現有還無法達到單顆細胞的程度。¹⁴ 而進一步 的多組學（Multi-omics study）如蛋白體學、代謝體學則因為篇幅關係就不贅述。科技會持續進步，但筆者認為不變的重點是如何完整且品質良好的保存肌肉檢體，才不會有新的檢驗方 法但沒有檢體的困境。

結語

肌肉切片是個古典具有歷史的臨床處置，其面貌隨著時代而不斷改變。筆者在肌肉病理 的學習上還是後學末進，以上的內容已盡力翻 找文獻整理，然而肌肉病理分析是個廣泛且艱深的學問，若有謬誤之處，再請各位前輩師長給予指導

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2. Clarac F, Massion J, Smith AM. Duchenne, Charcot and Babinski, three neurologists of La Salpetrière Hospital, and their contribution to concepts of the central organization of motor synergy. J Physiol Paris 2009; 103(6): 361-76.

3. Jongebloed WL, Stokroos, D., Kalicharan, D., and Van der Want, J.J.L. Is Cryopreservation Superior Over Tannic Acid/Arginine/ Osmium Tetroxide non-Coating Preparation in Field Emission Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy 1999; 13: 93- 109.

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